热处理对喷砂、酸蚀及H₂O<sub>2</s(3)

表2 两组钛片表面成骨细胞黏附及增殖能力检测结果比较 万个组别 培养1 h 培养3 h 培养24 h 培养4 d 培养8 d对照组 0. 1. 1. 5. 9.实验组 0. 0. 1. 3. 6.值6.83 2.36 0.17 11.21 3.94值 ＜0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

虽然实验组的锐钛矿晶体结构有利于成骨细胞的黏附、增殖和分化，但是对照组钛片表面的Ti-OH及TiH2结构可能同样有利于成骨细胞的生长和功能表达。也许Ti-OH及TiH2结构对成骨细胞生长的促进作用超过了锐钛矿结构的促进作用，这可能是对照组钛片更有利于成骨细胞生长的原因。当然，本研究只是观察到了种植体表面改性过程中的一种现象，具体的机制还需要进一步研究。

纯钛及钛合金由于其良好的生物相容性和卓越的机械性能而被广泛应用于牙种植体。但是，一般而言钛金属本质上是生物惰性的，很难直接与周围骨组织形成稳定牢固的骨结合。于是，学者们想出各种方法（如机械打磨、喷砂、酸蚀及热处理等）对种植体表面进行改性，以期获得良好的生物活性，促进成骨细胞的生长和种植体周围骨组织的形成[1-3]，但最近有研究表明热处理可能会改变种植体表面的结构和性能，从而产生有利或不利的影响[4-5]。本研究拟将成骨细胞接种到不同的钛片表面进行培养，观察成骨细胞早期黏附、增殖及分化的情况，以探讨热处理对该种植体表面活性的影响。现报道如下。1 资料与方法1.1 材料及试剂 商业纯钛片，直径为10 mm或30 mm，厚2 mm（宁波广慈医疗器械有限公司）；胎牛血清、-MEM培养基及胰酶（Gibco公司，美国）；曲拉通（TritonX-100，Sigma公司，美国）；多聚甲醛（Paraformaldehyde，ProSciTech公司，澳大利亚）；鬼笔环肽（Rhodamine phalloidin，Sigma公司，美国）；碘化丙啶（Propidiumiodide，Sigma公司，美国）；碱性磷酸酶活性测定试剂盒（Wako公司，日本）；骨钙素含量检测试剂盒（Biomedicaltechnology公司，美国）。荧光正置相差显微镜（ECLIPSE-80I，Nikon公司，日本）；多光谱酶标仪（产品型号：Spectra-Max Plus 384，厦门市宝能科技有限公司，中国）；图像处理软件（Image-proplus4，Media Cybernetics公司，美国 方法1.2.1 钛片表面处理及分组 钛片表面先用320、500、800和1200目碳化硅水磨砂纸逐级打磨抛光，然后经大颗粒金刚砂喷砂处理，压力为4MPa；接着依次置于丙酮、75%乙醇、去离子水中各超声清洗15min，50℃干燥后备用。将喷砂清洗后的钛片用0.11mol/LHF和0.09mol/LHNO3混合液处理10 min，去离子水冲洗，50℃干燥；然后放于80℃的5.8 mol/L HC1和8.96 mol/L H2SO4混合液中浸泡30min，冲洗干燥；再接着用80℃的0.1 mol/L HCl和8.8 mol/L H2O2的混合液处理20min，冲洗干燥；最后，随机选取一半经过以上步骤处理的钛片设为对照组（9片），剩下的一半钛片经400℃高温处理1 h并自然冷却，设为实验组（9片）。所有的钛片均分别用丙酮、75%乙醇、去离子水各超声清洗15min，50℃干燥后即可进行表面表征，而用于细胞培养的钛片需在紫外线下正反面各照射 细胞培养 将两组钛片分别放入24孔和6孔细胞培养板中，将传至第3代的小鼠颅骨来源的成骨前体细胞（MC3T3-E1）接种到材料表面；接种密度：直径为10mm的小钛片1×104个细胞/片，直径为30mm 的大钛片1×105个细胞/片。加入含10%胎牛血清的培养液1ml或3ml，在37℃、95%湿度、5%CO2的孵箱中密闭培养，每3天更换1次培养基 细胞形态观察 将分别培养了1、3和24h的小钛片取出，先用37℃的PBS溶液轻轻漂洗，以去除未牢固粘附的细胞，接着用4%多聚甲醛溶液在4℃冰箱固定30min，继续用PBS冲洗3遍；0.1%曲拉通渗透3 min，PBS冲洗3遍，牛血清白蛋白非特异性封闭3min；接下去用结合有FITC的鬼笔环肽（5 g/ml）在37℃避光的条件下处理50 min，PBS冲洗3遍；最后用50g/ml的碘化丙啶同样在37℃避光的条件下5 min，PBS充分漂洗以去除残余的染料。经过染色的钛片马上用荧光正置相差显微镜观察并摄片。每片钛片任选10个视野摄片，并随机选择30个细胞用于细胞形态因子分析[6]。所有图片用专用软件处理，其中细胞形态因子的计算公式为：=4 A/p2，A代表细胞伸展的面积，P表示细胞的直径。当形态因子为最大值1时代表一个完美的圆，而细线形状物体的形态因子为最小，趋向于 成骨细胞的早期黏附和增值能力检测 两组钛片分别于接种细胞后1h、3h、24 h、4 d和8 d取出，用PBS洗去未附着的细胞，同时将接种了细胞的钛片转移到新的细胞培养板中（减少附着在细胞培养板上而不是钛片上的成骨细胞的干扰影响），每孔加入1 ml柠檬酸缓冲溶液，置于－80℃低温冰箱中保存。等样品收集完毕，用反复冻融法将所有的样品连续冻融3次，收集细胞裂解液，离心，取上清液用于细胞DNA含量测定。本研究采用特定的试剂盒检测总的细胞DNA含量来推测细胞数。根据厂家提供的检测说明，20 l上清液置于96孔细胞培养板中，再用80 l TE工作液稀释，接着加入100 l picoGreen工作液，避光室温孵育2～5 min，多光谱酶标仪测量荧光强度（Ex485nm/Em510nm）。最后，根据标准曲线求出待测样品DNA的含量 碱性磷酸酶（ALP）活性测定成骨前体细胞在钛片表面分别培养4、7和14 d，弃去细胞培养基，用PBS清洗3遍，加特定细胞裂解液4℃作用15 min，收集后12 000 r/min 4℃离心15 min，取上清液。所有样本用ALP检测试剂盒检测ALP活性。具体操作方法为：取20 l待测样品与100 l工作液混合，37℃避光孵育15min，最后加80 l NaOH溶液终止反应，405 nm读取吸光度值求得ALP活性。同时用同样的样本经稀释后与BCA蛋白检测工作液混合，37℃避光孵育30min，570 nm读取吸光度值求得细胞总蛋白浓度。细胞内 ALP活性值均用相应的细胞总蛋白浓度予以校准，以获得相对ALP活性?骨钙素（OC）含量的测定 钛片表面培养的成骨细胞分泌的骨钙素主要是通过测量细胞培养基中的 OC含量来确定的。当培养14d后，收集全部的细胞培养基并记录其体积（ml），10 000 r/min 4 ℃离心15 min，取上清液测量OC含量。通过特定的OC含量测定试剂盒，采用ELLISA法来测定，完全依据试剂商提供的操作步骤进行。所测的骨钙素含量乘以细胞培养基的量得到细胞分泌的OC总量，最后用细胞总蛋白浓度校?统计方法 采用SPSS12.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用检验。＜0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 钛片表面细胞形态的观察结果 接种1h后，成骨细胞开始在钛片表面粘附伸展，可以观察到许多细小的细胞伪足（图1），而对照组的钛片表面（图2）黏附了更多的细胞，并且细胞的铺展面积明显大于实验组；到3h时，对照组钛片较实验组钛片表面的细胞铺展面积更大，可观察到许多粗大的细胞伪足；而培养24 h后，两组钛片表面的细胞基本上完全伸?两组细胞形态因子检测结果比较随着细胞培养时间的延长，细胞的形态因子逐渐变小，两组细胞形态因子在每一个检测时间点差异均有统计学意义（均＜0.05）。见表 两组钛片表面成骨细胞粘附及增殖能力检测结果比较 两组培养1h、4d及8 d钛片表面粘附的成骨细胞差异均有统计学意义（均＜0.05），而培养3及24 h时成骨细胞数量差异均无统计学意义（均＞0.05）。见表 两组碱性磷酸酶活性及骨钙素含量比较 对照组表面生长的成骨细胞在各时间点所表达的碱性磷酸酶活性均显著高于实验组（均＜0.05）。见表3。诱导培养 2周后，对照组的骨钙素含量为（）ng/mg，实验组（）ng/mg，两组差异有统计学意义（＜ 0.05）。3 讨论研究认为较小的细胞形态因子往往意味着较好的细胞伸展情况[6-7]。本研究结果显示，对照组钛片表面的细胞形态因子在各时间点均明显小于实验组，这表明对照组钛片更有利于成骨细胞的粘附和伸展。同时，成骨细胞黏附能力的检测结果也表明对照组钛片可能更有利于成骨细胞的生长，尤其是1 h时最明显。国外有研究认为，贴壁生长的细胞只有完全黏附伸展后才能开始功能表达[8]。所以，对照组钛片可能有利于成骨细胞的功能表达。关于细胞增殖能力的比较，同样是对图1 Mc3T3-E1细胞在钛片表面培养1、3和24 h后的形态学变化；注：a：培养1 h，b：培养3 h，c：培养24 h图2 Mc3T3-E1细胞在钛片表面培养1、3和24 h后的形态学变化；注：a：培养1 h，b：培养3 h，c：培养24 h表1 两组细胞形态因子检测结果比较组别 培养1 h 培养3 h 培养24 h对照组 0. 0. 0.实验组 0. 0. 0.值 9.00 5.00 3.45值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05表3 两组碱性磷酸酶活性比较 nmol/g/hr组别 培养4 d 培养7 d 培养14 d对照组 0. 0. 0.实验组 0. 0. 0.值 2.81 3.17 3.42值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05照组钛片更能促进细胞的增殖。碱性磷酸酶活性的检测结果及骨钙素含量的检测结果均提示对照组钛片更有利于成骨细胞的分化。上述结果似乎很难解释，因为以往的一系列体内及体外实验已明确证实H2O2/HCl酸蚀加400℃1 h处理后得到的种植体表面具有高度的生物活性，大大促进了成骨细胞的黏附、增殖和分化，有利于种植体与骨组织的结合[1-3]。根据Wang等[9-10]的研究，钛金属用H2O2/HCl溶液处理后会在表面形成无定形的氧化钛凝胶层；当继续在400℃高温下处理1 h，无定形的氧化钛会转变成有晶体结构的锐钛矿，并且这种锐钛矿氧化层在模拟体液中24 h内就能沉积出羟基磷灰石，显示出很高的生物活性。然而本研究显示，就是这种具有明显生物活性的表面，与对照组钛片相比却处于劣势。钛金属与过氧化氢溶液反应时，金属表面会带有大量的钛羟基（Ti-OH）[11]，而大量的Ti-OH是沉积羟基磷灰石（HA）必要的功能基团。高温处理会极大的破坏Ti-OH，所以实验组钛片表面的Ti-OH数量会明显的减少。也许这就是对照组钛片更有利于HA的沉积而显示出更高生物活性的原因。一旦钛金属与强酸处理，其表面就会有氢化钛（TiH2）形成；而400℃的高温能够轻易的将TiH2从钛表面除去[12]。当然，目前关于 TiH2对种植体表面生物活性的影响报道并不多。有研究认为，TiH2能够促进细胞的生长，促进种植体的早期骨整合[13]。可能的机制为：种植体表面的TiH2能够逐渐释放出氢离子（H+），而H+可能会与环境中的Ca2+交换，而Ca2+的沉积对于HA的形成是至关重要的；被释放的H+可能会攻击并打断Ti-O键，从而形成Ti-OH，而Ti-OH的形成对HA的沉积是同样重要的。表2 两组钛片表面成骨细胞黏附及增殖能力检测结果比较 万个组别 培养1 h 培养3 h 培养24 h 培养4 d 培养8 d对照组 0. 1. 1. 5. 9.实验组 0. 0. 1. 3. 6.值6.83 2.36 0.17 11.21 3.94值 ＜0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05虽然实验组的锐钛矿晶体结构有利于成骨细胞的黏附、增殖和分化，但是对照组钛片表面的Ti-OH及TiH2结构可能同样有利于成骨细胞的生长和功能表达。也许Ti-OH及TiH2结构对成骨细胞生长的促进作用超过了锐钛矿结构的促进作用，这可能是对照组钛片更有利于成骨细胞生长的原因。当然，本研究只是观察到了种植体表面改性过程中的一种现象，具体的机制还需要进一步研究。参考文献：[1]He FM,Yang GL,Li YN,et al.Early bone response to sandblasted,dual acid--etched and H2O2/HCl treated titanium implants：anexperimentalstudyintherabbit[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2009,38(6)：677-681.[2] Yang GL,He FM,Zhao SS,et of H2O2/HCl heat treatment of implants on invivoperi-implant boneformation[J].Int J Oral Maxillofac Implants,2008,23(6)：1020-1028.[3] Yang XF,Chen Y,Yang F,et initial adhesion of osteoblast-like cells on an anatase-structured titania surface formed by H2O2/HCl solution and heat treatment[J].DentMater,2009,25(4)：473-480.[4] Wei D,ZhouY,,cell response and biomimetic apatite induction of gradient TiO2-based/nano-scale hydrophilic amorphous titanium oxide containing Ca composite coatings before and after crystallization[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2009,74(1)：230-237.[5] Kim HM,Miyaji F,Kokubo T,et of heat treatment on apatite-forming ability of Ti metal induced by alkali treatment[J].J Mater Sci Mater Med,1997,8(6)：341-347.[6] Shah AK,Sinha RK,Hickok NJ,et morphometric analysis of human osteoblastic cell adhesion on clinically relevant orthopedic alloys[J].Bone,1999,24(5)：499-506.[7]Schuler M,Owen GR,Hamilton DW,et modification of titanium dental implant model surfaces using the RGDSP-peptide sequence：a cell morphology study[J].Biomaterials,2006,27(21)：4003-4015.[8] Anselme adhesion on biomaterials[J].Biomaterials,2000,21(7)：667-681.[9] Wang XX,Hayakawa S,Tsuru K,et of bioactivity of H(2)O(2)/TaCl(5)-treated titanium after subsequent heat treatments[J].J Biomed Mater Res,2000,52(1)：171-176.[10]Wang XX,Hayakawa S,Tsuru K,et al.A comparative study of in vitro apatite deposition on heat-,H(2)O(2)-,and NaOH-treated titanium surfaces[J].J Biomed Mater Res,2001,54(2)：172-178.[11]Osaka A,Tsuru K,Hayakawa derived from combined chemical and thermal treatments of titanium：In vitro apatite forming ability[J].Phosphorus Res Bull,2004,17：130-141.[12]Aronsson BO,Hjorvarsson B,Frauchiger L,et desorption from sandblasted and acid-etched titanium surfaces after glow-discharge treatment[J].J Biomed Mater Res,2001,54(1)：20-29.[13]Lamolle SF,Monjo M,Rubert M,et al.The effect of hydrofluoric acid treatment of titanium surface on nanostructural and chemical changes and the growth of MC3T3-E1 cells[J].Biomaterials,2009,30(5)：736-742.

文章来源：《材料热处理学报》 网址: http://www.clrclxbzz.cn/qikandaodu/2020/1104/349.html